Apa itu Spektrofotometer

Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.

Alat atau instrument yang satu ini dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra violet) ataupun cahaya tampak (visible). Masing-masing cahaya pada alat ini berguna untuk menangkap objek dengan panjang gelombang yang berbeda.
Sinar UV digunakan untuk mengukur sampel yang terbaca dengan panjang gelombang di bawah 400 nano meter (nm). Sedangkan visible light untuk mengukur sampel dengan panjang gelombang 400-700 nm. Beberapa contoh sampel yang dapat dibaca dengan alat yang berorientasi pada pengukuran kepekatan warna dengan panjang gelombang ini adalah DNA/RNA (260 nm), protein (280 nm), kultur sel bakteri, ragi/yeast (600 nm) dan lain-lain.

Penyerapan sinar UV dan sinar tampak oleh molekul akan melalui 3 proses yaitu penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, penyerapan oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks, dan terakhir penyerapan oleh perpindahan muatan.

Prinsip Spektrofotometer

Pada prinsipnya, alat ini adalah hasil penggabungan dari alat spektrometer dan fotometer. Spektrometer adalah alat yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. Spektrometer memiliki alat pengurai seperti prisma yang dapat menyeleksi panjang gelombang dari sinar putih.

Sedangkan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsikan. Pada fotometer terdapat filter dari berbagai warna yang memiliki spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu.

Bagian-bagian spektrofotometer terdiri dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. Berikut alur prinsip kerja dari suatu spektrofotometer:

Prinsip kerja alat ini berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitan adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io).
Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain:

1. Radiasi yang digunakan harus monokromatik,
2. Energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia,
3. Sampel (larutan) yang mengabsorbsi harus homogen,
4. Tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer).

:: sumber labsatu.